食源性致病菌高通量测序检测技术研究

食源性致病菌高通量测序检测技术研究

吴泽兰

身份证号： 440582199002182026

摘要：食源性疾病是由摄入受污染食物引起的疾病，对公共卫生构成严重威胁。食源性致病菌是引起食源性疾病的主要病原体，其快速准确的检测对于预防和控制食源性疾病至关重要。随着分子生物学技术的发展，高通量测序技术因其高通量、高灵敏度和高特异性特性，在食源性致病菌检测领域显示出巨大潜力。本文将综述高通量测序技术在食源性致病菌检测中的应用，探讨其在食品安全监管中的作用，并展望未来的发展趋势。

关键词：食源性致病菌检测、高通量测序技术、食品安全监管、生物信息学

1. 高通量测序检测技术在食品安全监管中的应用

1.1 食品安全监管中高通量测序技术的作用

高通量测序技术（High-Throughput Sequencing，HTS），也被称作下一代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）或大规模平行测序（Massively Parallel Sequencing，MPS），是一种高效的DNA测序方法，它能够在较短的时间内对众多DNA分子进行并行的序列分析。

目前在食品安全监管中扮演着越来越重要的角色。HTS技术以其高覆盖度、高灵敏度、高准确性和相对较低的成本，正在逐渐替代传统的DNA诊断和微生物分型方法，成为食品安全检测的关键技术。HTS技术能够提供微生物的详细遗传信息，有助于识别和追踪食源性致病菌，从而提高食品安全监管的效率和准确性。通过HTS技术，监管人员可以快速响应食品安全事件，进行风险评估，并采取相应的控制措施，以保护消费者健康[1]。

1.2 高通量测序技术在食品安全事件中的应用实例

在食品安全事件中，高通量测序技术的应用实例包括对食源性致病菌的快速鉴定和溯源。例如，在Salmonella typhimurium DT 8爆发的回顾性调查中，全基因组测序被用来追踪疫情的源头。此外，HTS技术也被用于分析食品样本中的微生物群落结构，以确定食品污染的来源和途径。通过比较不同样本的微生物基因组，HTS技术有助于揭示食品污染事件中的传播模式和潜在风险因素。

1.3 高通量测序技术在食品安全预警系统中的应用

高通量测序技术在食品安全预警系统中的应用，体现在其能够提供实时的微生物标记基因、全基因组和转录组数据，这些数据不仅揭示了食品供应中病原体的身份，还揭示了其毒力潜力和功能特征。基于高通量测序（HTS）数据，我们可以开发新模型来预测和应对食源性疾病爆发等关键事件。例如，利用HTS技术和机器学习可以构建一个果品真菌毒素污染的预警系统，该系统通过分析样本中的产毒基因丰度及其潜在危害，评估污染风险等级，从而实现对真菌毒素污染的及时预警和有效控制。

1.4 NGS技术在食源性致病菌检测中的应用

在食源性致病菌检测领域，NGS技术的应用正日益增多，其强大的高通量测序能力为食品微生物学带来了革命性的变化。NGS技术不仅能够提供病原体的遗传信息，还能够用于追踪疾病的传播和起源，这对于食源性细菌病原体的鉴定尤为重要。例如，NGS可以直接从食品样本中鉴定出多种病原体，如沙门氏菌和李斯特菌，对于病毒病原体的检测，NGS通常与其他方法结合使用，如RT-PCR，以确认阳性样本并进行进一步的序列分析。NGS技术的应用不仅限于检测已知的致病菌，它还能揭示新的或罕见的病原体，增强了食源性致病菌检测的全面性和深度。

此外，NGS技术在食源性致病菌检测中的应用还包括鸟枪法宏基因组测序和16S扩增子测序等方法。鸟枪法宏基因组测序是一种无需培养的微生物群落分析技术，它能够提供微生物群落的全面视图，包括未知和难以培养的微生物。而16S扩增子测序则专注于细菌的16S rRNA基因，这是一种高度保守的基因，可用于细菌的分类和鉴定。这些技术的应用，使得食品安全监管更为高效和准确。通过NGS技术，监管人员可以快速响应食品安全事件，进行风险评估，并采取相应的控制措施，以保护消费者健康。

2. 食源性致病菌高通量测序检测技术

2.1 高通量测序技术在食源性致病菌检测中的应用

HTS通过提取样品中的微生物总DNA或RNA，进行引物设计及PCR扩增，随后进行基因组测序，并基于数据库进行生物信息学分析，从而实现对食源性致病菌的快速鉴定。HTS技术能够提供详尽的微生物信息，包括样品中细菌的多样性、相对丰度及其变化趋势，这对于研究样品中微生物群落的组成和动态变化具有重要意义。

2.2 样本前处理与核酸提取技术

样本前处理和核酸提取是高通量测序技术中至关重要的步骤，它们直接影响到后续实验的顺利进行与结果的可靠性。在分子生物学研究中，核酸提取技术的目标是从复杂的生物样本中精准分离出DNA或RNA分子。这一过程通常包括细胞裂解、核酸的分离与纯化，以及核酸的浓缩与沉淀。例如，乙醇沉淀法因其高效与便捷，成为了核酸浓缩与沉淀的首选方法。在DNA提取过程中，还可以加入RNase酶以降解样本中的RNA，确保所得DNA的纯度。而在RNA提取中，则细分为总RNA与miRNA的提取，这对于揭示RNA在基因调控中的关键作用至关重要。核酸提取的成功与否，直接关系到后续实验如PCR、qPCR、克隆及测序等的顺利进行。因此，选择合适的提取方法，并依据样本特性进行合理处理，是实现核酸提取目标的关键[2]。

2.3 测序平台的选择与比较

在食源性致病菌的高通量测序检测中，选择合适的测序平台对测序结果的可靠性、减少测序错误，提高后续数据分析的准确性、缩短检验周期和成本至关重要，通过选择性价比高的测序平台，可以在预算范围内获得最佳的测序效果。

目前市场上主要的测序平台包括Illumina、BGI/MGI（华大基因）、Thermo Fisher（Ion Torrent）、Oxford Nanopore、PacBio等。它们各自具有独特的优缺点，以下是对这些测序平台的比较：

Illumina

优点

高通量：Illumina测序平台能够生成大量的数据，适用于大规模转录组分析。

精确度高：具有较低的测序错误率，适合进行细致的基因表达分析。

应用广泛：在基因表达定量、基因剪接分析、突变检测等方面有广泛应用。

缺点

读长较短：通常为100~150bp，在复杂的转录本拼接和基因组结构变异分析中可能存在局限性。

成本较高：需要昂贵的二代测序仪，且对生物信息学的要求很高。

BGI/MGI（华大基因）

优点

国产优势：打破了国外测序仪厂商的长期垄断，降低了终端用户价格。

技术先进：采用独特的DNA纳米球测序原理和滚环扩增技术，确保准确性更高。

性能优越：在全基因组测序和单细胞测序中能提供相当水平的测序质量。

缺点

与Illumina相比：在某些特定场景如微生物宏基因组检测中，可能存在一定的性能差异。

Thermo Fisher（Ion Torrent）

优点

成本较低：与Illumina相比，测序成本更低。

操作简便：测序流程相对简单，易于操作。

缺点

通量较低：不适合大规模测序项目。

准确性可能受限：在某些复杂应用场景中，准确性可能不如Illumina等平台。

Oxford Nanopore

优点

长读长：Reads可达Mb级别，适合大基因组拼接和全长转录本分析。

设备成本低：测序芯片可清洗再生，重复利用。

实时测序：最快可在1小时内完成测序流程及数据分析。

缺点

错误率较高：尤其是在基因表达定量和突变检测时，可能需要后续的数据修正和过滤。

通量较低：在深度测序方面的通量较低，适合做小规模实验。

PacBio

优点

长读长：提供长读长数据，适合处理复杂的基因组和转录组结构。

无需PCR扩增：避免了PCR扩增所带来的偏倚，能更好地反映原始样本中的转录本。

直接检测表观修饰：能够直接检测DNA的表观修饰，如甲基化等。

缺点

错误率相对较高：通常需要通过错误修正技术来提高数据质量。

通量较低：测序通量较低，适合高精度、低通量的测序项目。

成本较高：测序成本相对较高，在一定程度上限制了其在大规模测序项目中的应用。

Illumina平台以其高通量、高准确度和成熟的生物信息学分析方法而成为主流选择，尤其适合于多样性样本和多种生物学应用，如RNA-Seq、ChIP-Seq等。然而，Illumina平台的读长通常不超过600bp，难以解析重复区域和结构变异，对输入DNA质量要求较高。相比之下，PacBio和Oxford Nanopore等第三代测序技术提供了更长的读长，有助于解决基因组复杂区域的组装和结构变异分析问题，尤其适用于全基因组测序、基因组结构分析等领域。尽管第三代测序技术在长读长方面具有优势，但其单个测序成本相对较高，原始测序错误率也较高，通常需要多次重复测序以提高准确性。各测序平台在优缺点方面存在显著差异。在选择测序平台时，需要根据具体的研究目的、样本类型、测序需求以及预算等因素进行综合考虑。

2.4 数据分析与生物信息学工具

高通量测序产生的大量数据需要通过生物信息学工具进行有效分析。数据分析的第一步通常是reads比对到参考基因组，这一步骤可以使用如Blast、Bowtie或BWA等工具。随后，需要进行变异检测、基因表达分析、表观遗传学分析等，这些分析可以通过GATK、SAMtools、Cufflinks等软件包来实现。对于食源性致病菌的检测，特别关注的是病原体的鉴定和耐药基因的分析，这可能需要使用到如CARD、ResFinder和ARG-ANNOT等专门针对抗生素抗性基因的数据库和分析工具。此外，宏基因组学分析工具如MEGAN和QIIME允许研究者探索微生物群落的结构和功能，这对于理解食源性致病菌在复杂样本中的生态角色至关重要。在数据分析过程中，选择合适的生物信息学工具和数据库对于确保结果的准确性和可靠性至关重要，同时也需要考虑到分析的复杂性和计算资源的需求[3]。

3. 未来展望与挑战

随着基因组学技术的快速发展，高通量测序技术（HTS）在食源性致病菌检测领域的应用正迅速增长。该技术能够提供微生物的详细遗传信息，这不仅有助于识别和追踪已知的食源性致病菌，还能发现新的或罕见的病原体，从而增强检测的全面性和深度。这一技术的进步，加之测序成本的降低和应用场景的成熟，预示着HTS技术在未来食源性致病菌检测中将继续保持高速增长。然而，HTS技术在样本前处理和核酸提取的效率上仍面临挑战，这直接影响实验的顺利进行和结果的可靠性。为了克服这些挑战，科研人员正在探索更高效的裂解和纯化方法，并致力于开发更快速、更经济、更准确的核酸提取和测序技术，以及更先进的数据分析方法。同时，高通量测序数据的分析需要强大的计算能力和专业的生物信息学工具，因此，开发更高效的数据分析算法和软件也是研究的重点。政策与法规的制定对HTS技术的应用也起到了关键作用，我国已经出台了《食品安全国家标准 食品生产通用卫生规范》（GB 14881-2013）和《高通量测序仪标准》（YY/T 1723-2020）等政策与法规，以规范和指导HTS技术的发展，确保检测结果的准确性和可靠性，体现了我国在高通量基因测序领域的前瞻性和先进性。

4. 结语

高通量测序技术不仅显著提升了检测的效率和准确性，而且在食品安全监管领域扮演着越来越重要的角色。尽管存在一些技术和法规上的挑战，但随着技术的不断进步和政策的逐步完善，高通量测序技术有望在未来的食品安全检测中扮演更加关键的角色。本研究的目的是为食品安全领域的研究人员和监管机构提供参考，以促进食源性致病菌检测技术的发展和应用，保障公众健康。

参考文献

[1] 付博菲,朱晓龙,邱斌.高通量测序技术在食源性病原体快速检测中的应用进展[J].食品研究与开发, 2019, 40(3):6.DOI:CNKI:SUN:SPYK.0.2019-03-038.

[2] 高雯暄,甘芝霖,陈爱亮,等.核酸技术在食源性致病菌检测中的研究进展[J].食品安全质量检测学报, 2020, 11(24):11.

[3] 吴 怡,刘露露,吴永民,等.高通量测序检测米线中的食源性致病菌[J].Shipin Kexue/ Food Science, 2022, 43(6).DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210115-165.

[4] 王文叶,陈雪波.高通量测序技术在食品微生物检测中的应用[J].饮食保健 2021年16期, 285页, 2021.